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医疗器械微生物检验讲义_图文

医疗器械微生物限度检验
何燕英 heyy2006@126.com 广东省医疗器械质量监督检验所
2010年12月
1

概述
? 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂 及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

微生物限度检查

细菌、真菌菌落数 控制菌

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概述
? 微生物:形体微小,结构简单,通常要用光学显 微镜和电子显微镜才能看清楚的生物
? 特点: 1、 个体微小,一般<0.1mm 2、构造简单,有单细胞的,简单多细胞 的,非细胞的 3、进化地位低
? 分类:原核类:二菌,四体(细菌、放线菌、螺旋体、 支原体、立克次氏体、衣原体) 真核类:真菌,原生动物,显微藻类 非细胞类:病毒,亚病毒
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概述
? 按医疗用品与人体接触的性质以及对人体使用安 全性要求分三类: a)Ⅰ 类医疗用品:接触人体完整皮肤的医疗 用品 b) Ⅱ类医疗用品:接触人体未破损粘膜的医疗 用品 c) Ⅲ类医疗用品:进入人体无菌组织、器官和血液 以及接触破损皮肤和粘膜的医疗 用品
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常用检测标准
? 《中华人民共和国药典》 2010年版二部附录XI J “微生物限度检查法”。
? GB 15979-2002 《一次性卫生用品卫生标准》附录B
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项目 《药典》2010

GB15979-2002

细菌 定量:营养琼脂培养基 2个平皿

定量:营养琼脂培养基 5个平皿

真菌

定量:玫瑰红钠琼脂培养基 至少2个平皿 72h 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基

定量:沙氏琼脂培养基 5个平皿 7天 定性:沙氏液体培养基 7天

大肠 胆盐乳糖培养基 、MUG培养基

/

埃希菌 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基

大肠 菌群

胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵培

凯琼脂培养基 、乳糖发酵培养基

养基

沙门菌

营养肉汤 、四硫酸钠亮绿培养基 、胆盐硫乳琼脂(或 / 沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红 亚蓝琼脂)培养基 、三糖铁琼脂培养基

铜绿假单 胆盐乳糖 、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 、氧化酶 SCDLP培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养

胞菌 试验 、绿脓菌素试验、

基 、氧化酶试验 、绿脓菌素试验、硝酸盐还原

产气试验、明胶液化试验42℃生长试验

金黄色 亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)培养基 、卵黄氯 葡萄球菌 化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基 、血浆凝
固酶试验

SCDLP培养基、血琼脂培养基、甘露醇发酵试 验、血浆凝固酶试验

梭菌

庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基 、过 / 氧化氢酶试验

溶血性链 / 球菌

葡萄糖肉汤、血琼脂培养基、链球菌试验、杆 菌肽敏感试验

白色念珠 沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念 /



珠菌显色培养基、1%聚山黎脂80-玉米琼脂培养基、芽

管试验

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实验条件
? 无菌操作技术 ? 实验环境 ? 实验器材
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无菌操作技术
? 微生物学基础 ? 微生物实践基础 ? 无菌操作意识
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实验环境
? 洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空 气区域或隔离系统
? 定期按GB/T16292-16294-1996《医药工业洁净 室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》 的现行国家标准进行洁净度验证
? 实验中监控:实验时将制备好的营养琼脂平板打 开放于实验台上,至实验结束收起,30 ℃ ~35℃
培养48h,菌落平均数应小于1cfu/φ90mm
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实验器具
? 仪器 超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸 汽灭菌器、薄膜过滤装置、比浊仪等。
? 用具 试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精 密pH试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、 牛皮纸等。
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实验准备
? 实验环境保证 ? 实验试液 ? 培养基 ? 灭菌方法
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实验环境保证
? 环境清洁,表面消毒( 75%(V/V)乙醇、新 洁尔灭(1:1000)溶液或其他适宜消毒溶液)
? 空气过滤系统,紫外灯或臭氧空气消毒仪
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实验试液
? 稀释剂 1.0.9%氯化钠溶液 2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 3.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液:调解pH至近中性,其中蛋 白胨对菌细胞有保护作用,有利于菌落数及控制菌测定。
? 表面活性剂、中和剂或灭活剂 ? 鉴定用试剂
1.靛基质试液 2.1%二盐酸二甲基对苯二胺试液(氧化酶试液) 3.三氯甲烷 4.1mol/l盐酸试液
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培养基
? 标准菌株处理及增菌用培养基 ? 选择性培养基 ? 鉴别培养基
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培养基
? 培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。应 按各种培养基要求准确测定调节pH值。多 数细菌生长的适宜pH值为7.2~7.6。酵母菌 霉菌(6.0~6.5)。 调节可用1N HCl或 NaOH。
? 培养基的灭菌时间和温度,应按照各种培 养基的规定进行,以保证灭菌效果及不损 失培养基的必需营养成分。
? 制成的培养基应透明,以便观察细菌生长 性状以及其他代谢活动所产生的变化。
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灭菌方式
? 湿热:115 ℃ ~121 ℃,15min~30min 物品切勿立即取出置冷处,以免急速冷却, 使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压,以致染 菌。
? 干热:160 ℃~ 170 ℃ ,2h 适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭菌。
? 灭菌程序需要经过验证
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计数培养基适用性检查
? 细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行 培养基的适用性检查,成品培养基、由脱 水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
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计数培养基适用性检查

? 菌种

? 大肠埃希菌

[CMCC(B)44 102]

? 金黄色葡萄球菌 [CMCC(B) 26 003]

? 枯草芽孢杆菌 [CMCC(B) 63 501]

? 白色念珠菌

[CMCC(F) 98 001]

? 黑曲霉

[CMCC(F) 98 003]

? 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌 种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代),并采 用适宜的菌种保藏技术,以保证试验菌株的生物 学特性。

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计数培养基适用性检查
? 菌液制备 细菌新鲜培养物(一般18h~24h,白念24h~48h , 黑曲霉 5~7天 ),用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数50cfu~100cfu的菌悬液 (黑曲霉用含 0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液)
? 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存在 2℃ ~8℃可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液 可保存在2℃ ~8℃,在验证过的贮存期内使用。
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计数培养基适用性检查

? 培养基接种

营养琼脂培养基

金黄色葡萄球菌2个平皿 大肠埃希菌2个平皿 枯草芽孢杆菌2个平皿

玫瑰红钠琼脂培养基 白色念珠菌2个平皿 黑典霉2个平皿

酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基:白色念珠菌2个平皿

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计数培养基适用性检查
? 结果判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照 培养基上的菌落平均数的70%,且菌落形态 大小应与对照培养基上的菌落一致,判该 培养基的适用性检查符合规定。
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样品准备
? 供试品进入无菌实验室前应作表面消毒, 用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻 底消毒。
? 检验数量:应从2个以上最小包装单位中抽 取供试品,膜剂还不得少于4片。
? 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小 包装单位)的3倍量供试品。
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样品准备
? 检验量:除另有规定外,一般供试品的检 验量为10 g或10ml;化学膜剂100cm2;贵重 药品、微量包装药品的检验量可以酌减。 要求检查沙门菌的供试品,其检验应增加 20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试 验)。
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供试液制备
? 液体供试品、固体、半固体或黏稠液供试品 取10ml或10g用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml,混匀,作为1:10 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀 水溶性液体亦可用混合供试品原液作为供试液
? 非水溶性供试品 :乳化或萃取 ? 膜剂供试品 :取供试品100cm2,剪碎,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓
冲液100ml浸泡,振摇,作为1:10的供试液 ? 肠溶及结肠溶制剂供试品:取供试品10g ,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液
(用于肠溶制剂)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml, 置45℃水浴中,振摇,使溶解,作为1:10的供试液 ? 气雾剂、喷雾剂供试品 ,经处理后同第一项制备供试液 ? 贴剂供试品 ? 具抑菌活性的供试品 :培养基稀释法 、离心沉淀法 、薄膜过滤法 、 中和法
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 实验方法 ? 倾注平皿法 ? 薄膜过滤法 ? 培养基 ? 细菌总数:营养琼脂培养基
? 霉菌及酵母菌计数:玫瑰红钠琼脂培养基、酵母 浸出粉胨葡萄琼脂培养基
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 培养和计数 ? 除另有规定外,细菌培养3天,逐日点计菌落数 ? 霉菌、酵母菌培养5天,逐日点计菌落数 ? 必要时可延长至7天进行菌落计数
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 方法验证 ? (1)试验组
平皿法:供试液1ml +1ml 试验菌菌悬液,平行制备2个 平皿,菌落计数
薄膜过滤法:供试液,过滤,冲洗,在最后一次的冲洗 液中加入1ml试验菌,过滤,菌落计数 ? (2)菌液组 测定所加的试验菌数。 ? (3)供试品对照组 取规定量供试液,按菌落计数方法测 定供试品本底菌数。 ? (4)稀释剂对照组 若供试液制备需要分散、乳化、中 和、离心或薄膜过滤等特殊处理时,应增加稀释剂对照组, 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。稀释剂+ 试验菌菌悬液
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 验证试验至少应进行3次独立的平行试验,并分别 计算各试验菌每次试验的回收率
? 结果判断 ? 在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的菌回
收率应均不低于70% ? 若试验组的菌回收率均不低于70%,可照该供
试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌 及酵母菌数 ? 若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%, 应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、 中和 法等方法或联合使用这些方法消除供试品的 抑菌活性,并重新进行方法验证
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 1.平皿法 ? 采用平皿法进行菌数测定时,应取适宜的连续2~3
个稀释级的供试液。 ? 取供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入
15~20ml 温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养 基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄琼 脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每 种培养基至少制备2个平板。 ? 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml,置无菌平 皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数 的培养基各制备2个平板,均不得有菌生长。
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细菌、霉菌及酵母菌计数
营养琼脂-细菌 玫瑰红钠琼脂培养基-霉菌
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 1.平皿法 ? 菌数报告规则: ? 细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300、霉菌宜
选取平均菌落数小于100的稀释级,作为菌数报告 (取两位有效数字)的依据。 ? 以最高平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml 或10cm2供试品中所含的菌数 ? 如果各稀释级的平板均无菌落生长,或仅是最低 稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时, 以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 2. 薄膜过滤法 ? 取相当于每张滤膜含1g或1ml供试品的供试液,加
至适量的稀释剂中,混匀,过滤。若供试品每1g 或1ml 所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供 试液1ml ,过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲 液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗后取出滤 膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠培 养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培 养。每种培养基至少制备一张滤膜。 ? 阴性对照试验 取试验用的稀释液1ml,照上述薄 膜过滤法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有 菌生长。
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 2. 薄膜过滤法 ? 菌数报告规则:以相当于1g或1ml供试品的
菌落数报告菌数;若滤膜上无菌生长,以 <1报告菌数(每张滤膜过滤 1g或1ml供试 品),或<1乘以稀释倍数的值报告菌数。
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细菌、霉菌及酵母菌计数
? 在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、 玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵 母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵 母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼 脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌 数进行比较,以菌落数较高的培养基中的菌数为计数结果。
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控制菌检查法验证

? 菌种(菌液制备同前)

? 大肠埃希菌

[CMCC(B)44 102]

? 金黄色葡萄球菌 [CMCC(B) 26 003]

? 乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B) 50 094]

? 铜绿假单胞菌 [CMCC(B) 10 104]

? 生孢梭菌

[CMCC(B) 64 941]

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控制菌检查法验证
? (1)试验组 取规定量供试液及10cfu~100cfu试验菌加入增菌培养基 中,依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,取规定量 供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,注 入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
? (2)阴性菌对照组 设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法 的专属性。方法同试验组,验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查 法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌;验证铜绿假单胞菌、金黄色 葡萄球菌,梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌 不得检出。
? 结果判断 阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌, 按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查;若试 验组未检出试验菌,应采用培养基稀释法、离心沉淀法 、薄膜过滤法、 中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新进 行方法验证。
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大肠埃希菌检验
? 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种 至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时,必要 时可延长至48小时。
? 取上述培养物0.2ml,接种至含5ml MUG培养基的试管内,培养,于5 小时、24小时在366nm紫外线下观察,同时用未接种的MUG培养基作 本底对照。若管内培养物呈现荧光,为MUG阳性,不呈现荧光,为 MUG阴性。观察后,沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫 瑰红色,为靛基质阳性;呈试剂本色,为靛基质阴性。本底对照应为 MUG阴性和靛基质阴性。
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MUG

大肠埃希菌检验
靛基质试验

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大肠埃希菌检验
? 如MUG阳性、靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌;如MUG阴性, 靛基质阴性,判供试品未检出大肠埃希菌;如MUG阳性、靛基质阴性, 或MUG阴性、靛基质阳性,均应取胆盐乳糖培养基的培养物划线于曙 红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。
? 若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符, 判供试品未检出大肠埃希菌 。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落 形态特征相符或疑似,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试 验,确认是否为大肠埃希菌。
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大肠埃希菌检验

? 大肠埃希菌菌落形态特征

培养基

菌落 形 态

曙红亚甲蓝琼脂 麦康凯琼脂

呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色、 菌落中心呈 深紫色或无明显暗色中心、 圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑, 湿润,常有金属光泽
鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深 桃红色,圆形,扁平,边缘整齐, 表面光滑,湿润

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大肠菌群检验
? 取含适量(不少于10ml)的胆盐乳糖发酵培养基管3支, 分别加入1:10的供试液1ml(含供试品0.1g或 0.1ml)、1: 100的供试液1ml(含供试品0.01g或 0.01ml )、1:1000的 供试液1ml(含供试品0.001g或 0.001ml),另取1支胆盐乳 糖发酵培养基加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18~24 小时。
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大肠菌群检验
? 胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气,判该管未检 出大肠菌群;若产酸产气,应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙 红亚甲蓝培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。
? 若平板上无菌落生长,或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符 或为非革兰阴性无芽孢杆菌,判该管未检出大肠菌群;若平板上生长 的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似,且为革兰阴性无芽孢 杆菌,应进行确证试验。
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大肠菌群检验

大肠菌群落形态特征

培养基 曙红亚甲蓝琼脂

菌落 形 态
呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色,圆 形,扁平或稍凸起,边缘整齐,表面光 滑,湿润

麦康凯琼脂

鲜桃红色或粉红色,圆形,扁平或稍凸 起,边缘整齐,表面光滑,湿润

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大肠菌群检验
? 确证试验 从上述分离平板上挑选4~5个 疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培 养24~48小时。若产酸产气,判该乳糖发酵 管检 出大肠菌群,否则判未检出大肠菌群。
? 根据大肠菌群的检出管数,按下表报告1g或 1ml供试品 中的大肠菌群数。
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可能的大肠菌群数表
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沙门菌检验
? 取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至适量(不少于200ml)的营养肉汤 培养基中,用匀浆仪或其他适宜方法混匀,培养18~24小时。
? 取上述培养物1ml,接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,培养18~24小时后, 分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼 脂(或曙红亚蓝琼脂)培养基的平板上,培养18~24小时(必要时延长至 40~48小时)。
? 若平板上无菌生长,或生长的菌落不同于下表所列的特征,判供试品未检出 沙门菌。
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沙门菌检验
? 沙门菌菌落形态特征
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沙门菌检验
? 若平板上生长的菌落与上表所列的菌落形态特征相符或疑似,用接种针挑选 2~3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培 养18~24小时,如斜面未见红色、底层未见黄色;或斜面黄色、底层无黑色, 判供试品未检出沙门菌。否则,应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适 宜的生化试验和血清凝集试验,确认是否为沙门菌。
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铜绿假单胞菌检验
? 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或 处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中, 培养18~24小时。取上述培养物,划线接种于溴化十六烷基 三甲铵琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。
? 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面 湿润,灰白色,周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落 生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未 检出铜绿假单胞菌。如平板上的菌落与上述菌落形态特征 相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养 基斜面上,培养18~24小时。取斜面培养物进行革兰染色、 镜检及氧化酶试验。
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铜绿假单胞菌检验
? 氧化酶试验 取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸 片上,滴加新配置的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内培养物呈粉红 色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。
? 若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均判供试品未检 出铜绿假单胞菌。否则,应进行绿脓菌素试验。
? 绿脓菌素试验 取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上,培养24小时, 加三氯甲烷3~5ml至培养管中,搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将三氯甲 烷相移至另一试管中,加入1mol/l盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,观察。 若盐酸溶液呈粉红色,为绿脓菌素试验阳性,否则为阴性。同时用未接种的 PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照,阴性对照试验应呈阴性。
? 若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性,判供 试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及 绿脓菌素试验阴性,应继续进行适宜的生化试验,确认是否为铜绿假单胞菌。
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金黄色葡萄球菌检验
? 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或 处理后接种至适量(不少于100ml)亚碲酸钠(钾)肉汤 (或营养肉汤)培养基中,培养18~24小时,必要时可延 至48小时。取上述培养物,划线接种于卵黄氯化钠琼脂培 养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,培养24~72小 时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于下表所列特 征,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
? 若平板上生长的菌落与下表所列的菌落特征相符或疑似, 应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上, 培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染 色,并接种于营养肉汤培养基中,培养18~24小时,作血 浆凝固酶试验。
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金黄色葡萄球菌检验

金黄色葡萄球菌菌落形态特征

培养基

菌落 形 态

甘露醇氯化钠琼脂 金黄色,圆形凸起,边缘整齐,
外围有黄色环,菌落直径
0.7~1mm

卵黄氯化钠琼脂

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,
外围有卵磷脂分解的乳浊圈,菌 落直径1~2mm

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金黄色葡萄球菌检验
? 血浆凝固酶试验 取灭菌小试管3支,各加入血浆和 无菌 水混合液(1:1)0.5ml,再分别加入可疑菌株的营养肉汤 培养物(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液) 0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物(或由营养琼脂培 养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、营养肉汤或0.9% 无菌氯化钠溶液0.5ml,即为试验管、阳性对照管和阴性对 照管。将3管同时培养,3小时后开始观察直至24小时。阴 性对照管的血浆应流动自如,阳性 对照管血浆应凝固,若 试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性,否则为阴性。 如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时,应另制备血浆, 重新试验。
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金黄色葡萄球菌检验
? 若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试 验阴性,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。
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梭菌检验
? 取供试液10ml (相当于供试品1g,1ml)2份,其中1份置80℃保温10 分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的 0.1%新鲜庖肉培养基中。各培养基管在厌氧条件下培养48小时。再取 上述培养物0.2ml,涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板 上,在厌氧条件下培养48~72小时。若平板上无菌落生长,判供试品 未检出梭菌;若平板上有菌落生长,应挑选2~3个菌落分别进行革兰 染色和过氧化氢酶试验。
? 过氧化氢酶试验 取上述平板上的菌落,置洁净玻片上,滴加3%过氧 化氢试液,若菌落表面有气泡产生,为过氧化氢酶试验阳性,否则为 阴性。
? 若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌,有或无卵圆形或球形的芽孢,过氧 化氢酶阴性,判供试品检出梭菌,否则判供试品未检出梭菌。
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白色念珠菌检验
? 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种 至适量(不少于100ml)的沙氏葡萄糖液体培养基中,培养48~72小时, 取上述培养物,划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上,培养 24~48小时。
? 菌落特征:乳白色,偶见淡黄色,表面光滑有浓酵母气味,培养时间 稍久则菌落增大,颜色变深,质地变硬或有皱褶。
? 若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于上述特征,判供试品未检出 白色念珠菌。
? 若平板上生长的菌落与上述特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分 别接种念珠菌显色培养基平板上,培养24~48小时。若平板上无绿色 或翠绿色的菌落生长,判供试品未检出白色念珠菌。
? 若有绿色或翠绿色的菌落生长,则挑取相符或疑似菌落接种于1%聚山 黎脂80-玉米琼脂培养基培养24~48小时,进行染色镜检及芽管试验。
? 若上述疑似菌为非革兰阳性菌,显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽 管,判供试品未检出白色念珠菌。
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谢谢大家!
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